تبلیغات
پژوهشسرای دانش آموزی پروفسور حسابی

پژوهشسرای دانش آموزی پروفسور حسابی
قالب وبلاگ
زیست فناوری از جمله واژه‌های پر سرو صدای سالهای اخیر است.این واژه را درست یا نادرست به مفهوم همه چیز برای مردم بکار می‌برند. زیست فناوری را در یک تعریف کلی به کارگیری اندامگان یا ارگانیسم یا فرایندهای زیستی در صنایع تولیدی یا خدماتی دانسته‌اند. تعریف ساده این پدیده نوین عبارت است از دانشی که کاربرد یکپارچه زیست شیمی ، میکروب شناسی و فناوریهای تولید را در سیستمهای زیستی به دلیل استفاده‌ای که در سرشت بین رشته‌ای علوم دارند مطالعه می‌کنند.در تعریف دیگر زیست فناوری را چنین تشریح کرده‌اند:

فنونی که از موجودات زنده برای ساخت یا تغییر محصولات ، ارتقا کیفی گیاهان یا حیوانات و تغییر صفات میکروارگانیسمها برای کاربردهای ویژه استفاده می‌کند.زیست فناوری به لحاظ خصوصیات ذاتی خود دانشی بین رشته‌ای است. کاربرد اینگونه دانشها در مواردی است که ترکیب ایده‌های حاصل در طی همکاری چند رشته به تبلور قلمرویی با نظام جدید می‌انجامد و زمینه‌ها و روش شناسی خاص خود را دارد و در نهایت حاصل بر هم کنش بخشهای گوناگون زیست شناسی و مهندسی است. زیست فناوری در اصل هسته‌ای مرکزی و دارای دو جزء است: یک جزء آن در پی دستیابی به بهترین کاتالیزور برای یک فرایند یا عملکرد ویژه است و جزء دیگر سیستم یا واکنشگری است که کاتالیزورها در آن عمل می‌کنند.

پیدایش زیست فناوری

سابقه استفاده از میکروارگانیسمها برای تولید مواد خوراکی نظیر سرکه ، ماست و پنیر به بیش از 8 هزار سال قبل برمی‌گردد. نقش میکروارگانیسمها در تولید الکل و سرکه در قرن پیش زمانی کشف شد که گروهی از بازرگانان فرانسوی در جست و جوی روشی بودند تا از ترش شدن شراب و آبجو ضمن حمل آنها با کشتی به نقاط دور جلوگیری کنند. آنان از لویی پاستور تقاضای کمک کردند.لویی پاستور پی برد که مخمرها در خلا قند را به الکل تبدیل می‌کنند. این فرایند بی هوازی تخمیر نام دارد. و نیزدریافت که ترشیدگی و آلودگی بر اثر فعالیت دسته باکتری اسید استیک که الکل را به سرکه تبدیل می‌کند روی می‌دهد.

لویی برای از بین بردن این مشکل فرایند
پاستوریزه کردن را موثر دانست که عبارت بود از گرمایش نوشیدنیها نظیر شیر یا غذاهای جامد نظیر پنیر یا گوشت حیوانات وحشی به منظور از بین بردن میکروارگانیسمهای مضر یا غیر ضروری و یا تعیین سرعت تخمیر از طریق اعمال حرارت معین. پاستور همزمان با این موضوع میکروبیولوژی کاربردی را پایه گذاری کرد و دریافت که بسیاری از میکروارگانیسمها اگر چه در انسان و سایر موجودات زنده ایجاد بیماری می‌کنند یکی از مهمترین عوامل تغییر مواد در طبیعت هستند.



تصویر

پنی سیلین و تولید مواد اولیه شیمیایی

پنی‌سیلین آنتی بیوتیکی است مشتق از کپک پنی سیلیوم نوتاتوم که برای درمان عفونتهای ناشی از انواع گوناگون باکتریها بکار می‌رود. از کشت سطحی پنی سیلیوم نوتاتوم پنی سیلین بدست می‌آید. این فرایند نه تنها پر زحمت است بلکه به دلیل استعداد آلودگی کشتها میزان تولید پنی سیلین را کاهش می‌دهد. ضرورت و نیاز کار در شرایط سترون منجربه توسعه راکتورهای مخزنی همزن دار شد که تا امروز به عنوان برترین روش کشت میکروبها در مقیاس وسیع بشمار می‌رود.

با کشف قابلیت میکروبها در تولید
آنتی بیوتیکها و درک کاربرد بالینی پنی سیلین ، توجه شرکتهای داروسازی بطور جدی به تولید آنتی بیوتیکها جلب شد. به منظور افزایش پتانسیل پادزیستی آنتی بیوتیکها بر حوزه وسیعی از میکروارگانیسمها لازم است که تحقیقات گسترده‌ای بر تولید آنتی بیوتیکهای جدید صورت گیرد. بنابراین استفاده از میکروارگانیسمهای به نژاد شده دراین زمینه مفید خواهد بود.

مهندسی ژنتیک و زیست فناوری نوین

در دهه 1980 ، زیست فناوری پیشرفت چشمگیری داشت که از قابلیت اتصال مولکولهای جدا شده از منابع مختلف در محیط آزمایشگاه نشات می‌گرفت. این اتصال ژن را در DNA دست ورزی ژنتیکی می‌نامند و چون پژوهشگر به نوترکیبی تناوب ژنی که از قبل وجود داشته می‌پردازد تا ترکیب جدید را بوجود آورد آن را نوترکیبی DNA نیز می‌نامند.

فناوری نوترکیبی DNA ، بیشتر در زمینه تولید پروتئینها کاربرد تجاری داشته است. این فناوری قادر است بسیاری از پروتئینهایی را که فرآورده‌های بی‌واسطه یک
ژن هستند و اساسا اهمیت درمانی دارند تولید کند. امروزه قابلیت اتصال ژنها انقلابی در صنایع بر پا کرده است و ثمره آن توسعه بی‌شمار فرآورده‌های جدید و بهبود فرایندهای شناخته شده فعلی است.



تصویر

مواد اولیه زیست فناوری

بیوماس (زیست توده)

بیوماس یک منبع انرژی تجدید شونده است که از طریق سوزاندن مستقیم آن با سیستمهای هضم کننده بی‌هوازی ، تقطیر تخریبی ، تبدیل به گاز ، هیدرولیز شیمیایی و زیست شناسی می‌توان از آن به عنوان منبع مستقیم انرژی و یا ترکیبات حامل انرژی استفاده کرد.

مواد خام طبیعی

خاستگاه مواد طبیعی ، کشاورزی و جنگل داری است.این مواد اساسا نوعی کربوهیدرات با ترکیبات پیچیده گوناگون شامل قند ، نشاسته ، سلولز و لیگنین هستند. مواد خام حاوی قند مانند نیشکر و چغندر فراوان‌ترین نوع مواد خام برای فراورده‌های زیست فناوری به شمار می‌رود.

دسترسی به فراورده های فرعی

اهداف اصلی زیست فناوری ، بهبود مدیریت و استفاده از مقادیر عظیم پسماند آلی است که در سراسر جهان یافت می‌شود. استفاده از این پسماندها یکی از منابع آلودگی را از بین خواهد برد و مهمتر از آن با بکارگیری فرایندهای زیست فناوری این پسماندها به صورت فراورده های فرعی مفید قابل استفاده خواهند بود.

مثالهایی از کاربرد زیست فناوری

در زمینه کاربردهای بیوتکنولوژی می‌توان به دو مثال زیر اشاره کرد.
  • می‌توان به تولید هورمون پروتئینی انسولین با استفاده از سلولهای باکتری اشاره کرد. ژن کد کننده این هورمون با استفاده ار تکنیکهای جدید در داخل پلاسمیدهای ویژه‌ای به درون باکتریها انتقال یافته و بیان می‌شوند. در وهله بعد می‌توان پروتئین مورد نظر را که توسط باکتریها بطور انبوه تولید می‌شود استخراج کرد و پس از خالص سازی در اختیار بیماران دیابتی قرار داد.

  • مثال دیگر تولید گیاهان مقاوم به حشرات است. امروزه مشخص شده است که پروتئینهای خاصی که از باکتری باسیلوس توریژنسیس استخراج می‌شود به دستگاه گوارش حشرات چسبیده و مانع جذب مواد غذایی می‌شود. در واقع پروتئینهای این باکتری برای حشرات سمی هستند. ژنهای کد کننده این پروتئینها را استخراج کرده و به ژنوم گیاهان مهم کشاورزی می‌افزایند. با بیان این ژن در داخل گیاهان این پروتئین سمی برای حشرات تولید می‌شود. حشراتی که به گیاه حمله کنند توسط این پروتئین از بین خواهند رفت.

کاربردهای مهندسی ژنتیک تقریبا نامحدود به نظر می‌رسد. این علم کاربردهای زیادی در علوم پایه و همچنین تولیدات صنعتی ، کشاورزی و علوم پزشکی دارد. در زمینه علوم پایه ، بررسیهایی مانند مکانیزمهای همانند سازی DNA و بیان ژنها در پروکاریوتها ، یوکاریوتها و ویروسها و همچنین چگونگی ساخته شدن و تغییرات پروتئینهای داخلی سلول و همچنین مکانیزم ایجاد سرطان از جمله کاربردهای مهندسی ژنتیک است. در زمینه کشاورزی که زمینه بسیاری از کاربردهای مهندسی ژنتیک بوده است، تولید گیاهان مقاوم به آفات گیاهی و خشکی ، تولید گیاهان پرمحصول و تولید گاوهای دارای شیر و گوشت بیشتر ، را می‌توان نام برد. در زمینه کاربردهای انسانی ، تشخیص بیماریهای ارثی ، تولید انسولین انسانی ، تولید هورمون رشد انسان و ... را می‌توان نام برد.

img/daneshnameh_up/8/85/16.jpg

تاریخچه

اهمیت بعضی از اصول علمی ، در زمان کشف آنها مشخص نمی‌شود، بلکه پس از مدت زمانی که می‌گذرد ارزش آنها معلوم می‌شود. یکی از مثالهای روشن این مساله کشف ساختمان سه بعدی DNA بوسیله واتسون و کریک در سال 1953 بود. این ساختمان نسبتا ساده باعث شد تا دانشمندان سیستمهای مختلف ژنتیکی را بررسی کنند. اما مطلب به همین جا ، ختم نشد و دانشمندان مختلف سعی کردند که از این اطلاعات استفاده نمایند. هدف آنها نیز بیان ساده‌ای داشت. آنها خواستند تا یک DNA را از یک موجود بگیرند و در موجود دیگر وارد نمایند تا اثرات آن ژن در موجود ثانویه بروز کند.

این علم نوین که به تدریج جای خود را در بین علوم دیگر پیدا کرد، با عناوین چون
زیست مولکولی ، مهندسی ژنتیک و نهایتا DNA نوترکیب (Recombinant DNA) نامیده می‌شود. مثالی معروف از کارهای مهندسی ژنتیک تولید یک نوع باکتری اشرشیاکلی (E.Coli) است که قادر است انسولین انسانی بسازد. یا تولید گیاهان مقاوم به شوری و خشکی.

مراحل مهندسی ژنتیک

  • انتخاب ژن مورد نظر
  • جداسازی ژن مورد نظر
  • وارد کردن ژن مورد نظر در حامل
  • تکثیر ژن در میزبان مناسب
  • انتقال حامل ژن به سلول هدف
  • تکثیر سلول هدف
  • تولید انبوه محصول یا ایجاد صفت مورد نظر

تولید DNA نوترکیب با استفاده از آنزیمهای محدود‌الاثر(Restriction)

  • گروهی از آنزیم های محدود‌الاثر هنگام برش ، توالیهای مورد شناسایی‌شان را بطور نامتقارن می‌شکنند، در نتیجه در انتهای قطعات DNA حاصله رشته‌های تکی با حدود 4 نوکلئوتید بوجود می‌آید که به این انتهای تک رشته‌ای ، انتهای چسبنده (Sticky end) می‌گویند. یکی از آنزیمها ECORI نام دارد که باعث ایجاد قطعاتی می‌شود که در انتهای خود ، چسبنده می‌باشند.

  • حال فرض کنید که دو قطعه متفاوت DNA بوسیله یک آنزیم محدودالاثر یکسانی برش داده شده‌اند، اگر قطعات حاصل از این برش با هم مخلوط شوند و شرایط مناسب فراهم شود انتهاهای چسبناک که مکمل هم می‌باشند بهم متصل می‌شوند. سپس بوسیله آنزیم DNA لیگاز این رشته‌ها به صورت کووالانسی بهم متصل می‌شوند.

  • هدف اصلی برش DNA در مهندسی ژنتیک ، اتصال دو قطعه DNA به یکدیگر می‌باشد. ولی هنگام اتصال قطعات DNA ممکن است بجای اینکه قطعات DNA بهم متصل شوند، دو سر یک مولکول DNA بار دیگر بهم بچسبند و در نتیجه نوترکیب صورت نگیرد. برای جلوگیری از این کار از آنزیم فسفاتاز قلیایی استفاده می‌کنند. به این صورت که پس از برش دادن حامل بوسیله آنزیم محدودالاثر فسفاتاز را به محیط واکنش می‌افزایند و در نتیجه فسفات انتهای 5 مولکول DNA در هر دو طرف جدا می‌شود و امکان اتصال دو سر مولکول حامل ، بدون DNA تازه ، به یکدیگر از بین می‌رود.

سیستمهای کلون کردن ژن

کلون کردن یک ژن خاص مهمترین مرحله مهندسی ژنتیک است. هدف از کلون کردن ژن به دست آوردن مقادیر زیادی از ژنهای خاص به صورت خالص می‌باشد. هدف اصلی کلون کردن ژن ، انتقال ژن مورد نظر از داخل یک ژنوم بزرگ و پیچیده به داخل یک حامل ساده و کوچک تکثیر آن است.

مراحل کلون کردن ژن

  • جداسازی و قطعه قطعه کردن منبع DNA: منبع DNA می‌تواند، ژنوم کامل یک موجود باشد که در این صورت، باید آن را بوسیله آنزیم محدودالاثر برش داد و قطعات حاصله را برای کلون کردن بکار برد.

  • اتصال به یک حامل کلون (Cloning Vector): حاملهای کلون ، قطعات ژنتیکی کوچکی هستند که بطور مستقل توانایی تکثیر دارند و دارای محل برش بوسیله آنزیمهای محدودالاثر می‌باشند، ولی این برش نباید در محل همانند سازی این حاملها باشد.

  • ورود به داخل میزبان:DNA نوترکیب حاصل به روشهای مختلف وارد باکتری یا میزبان مورد نظر می‌شود.

  • شناسایی و جداسازی کلون حاوی ژن مورد نظر: این مرحله شامل جداسازی میزبانهایی است که ژن مورد نظر بوسیله حامل وارد آنها شده و به نحو موثر بیان می‌شود.

  • تولید تعداد زیاد سلولها و یا باکتریهای حاوی ژن: این کار به منظور جداسازی و بررسی ژن مورد نظر ، انجام می‌گیرد.

حاملهای کلون (Cloning Vector)

پلاسمیدها

قطعات DNA حلقوی هستند. که در داخل سیتوپلاسم باکتریها و جدا از کروموزوم آنها قرار دارند و بطور مستقل تکثیر می‌شوند. پلاسمیدها ، خصوصیات مفیدی برای استفاده به عنوان حامل دارند مانند: اندازه کوچک ، DNA حلقوی ، همانند سازی مستقل ، تکثیر زیاد و شاخصهای مفید دیگر مانند دارا بودن ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک که جداسازی کلنی‌های حاوی پلاسمید را راحتتر می‌کند.

باکتریوفاژها (ویروس باکتری)

  • ویروسها به خاطر داشتن پروتئینهای خاص ، نفوذ بسیار موثر و اختصاصی را به داخل سلولهای میزبان انجام می‌دهند.
  • بعضی ویروسها در قسمتی از چرخه تکثیر خود ، نفوذ پایداری به داخل ژنوم میزبان دارند که این باعث پایداری بیان ژن در داخل سلول میزبان می‌شود.
  • ویروسها دارای پروموتورهای خاصی هستند که بوسیله سلولهای میزبانی شناخته می‌شوند و این باعث بیان مناسب ژنهای کلون شده می‌شود.

کازمیدها (Cosmids)

کازمیدها در حقیقت قطعات حاصل از دو انتهای ژنوم از دو انتهای ژنوم باکتریوفاژها لامبدا قرار بگیرند و در نتیجه وارد سلول Ecoli (باکتری اشرشیاکلی)شوند. در داخل سلول E.Coli این DNA به صورت حلقوی در آمده و مانند یک پلاسمید عمل می کند.

فاسمیدها

یکی دیگر از حامل‌های DNA نوترکیب هستند که ترکیبی از ژنوم باکتریوفاژ و پلاسمیدها هستند.

انتخاب میزبان مناسب

میزبان مورد نظر باید خصوصیاتی از قبیل پایداری ژنتیکی ، ژنوم کاملا شناخته شده مشخصات فیزیولوژیک معلوم ، توانایی پذیرش DNA خارجی ، داشتن یک شاخص خاص برای شناسایی در مواقع لزوم و ... را داشته باشد. یکی از شناخته شده ترین میزبانهای مورد استفاده باکتری E.Coli است. هنگام انجام کارهای ژنتیکی باید با مطالعاتی کافی یک سیستم حامل میزبان مناسب را انتخاب کرد و بکار برد. باسیلوس سوبتلیس (B.Subtilis) در مواردی که هدف از کلون کردن تولید یک پروتئین خالص می‌باشد، بر E.Coli ترجیح دارد. زیرا خصوصیات تخمیری این باکتری برای تولیدات صنعتی مناسب تر است.

روشهای وارد کردن حاملها به داخل میزبان

ویروسها و باکتریوفاژها

برای ویروسها و باکتریوفاژها و همچنین DNA نوترکیب که در داخل کپسید ویروس ها قرار گرفته‌اند (کاسمیدها) روش ورود واضح است و همانند ورود معمولی ویروس ها در سلول های میزبان است.

  • ترانسفورماسیون: برای این کار DNA نوترکیب را با باکتری مجاور می‌کنند. این روش یکی از متداولترین روشهای انتقال است.

  • الکتروپوریشن: در این روش قطعات DNA را در یک محیط دارای بار الکتریکی در مجاورت سلولها قرار می‌دهند. بار الکتریکی باعث ایجاد منافذ ریز در غشای سیتوپلاسمی می‌شود که این خود باعث تسهیل ورود قطعات DNA به داخل سلول می‌گردد.

  • تفنگ ذره‌ای یا تفنگ اسید نوکلئیک: در این روش دقیقا تنگی در مقیاس میکروسکوپی وجود دارد که گلوله آن قطعات DNA می‌باشد و DNA را به داخل سلول ، شلیک می‌کند.


 

img/daneshnameh_up/0/0a/b.Gen.10.gif


 

انتخاب کلونهای تغییر یافته

پس از اینکه DNA نوترکیب ساخته شد و در داخل باکتری میزبان ، انتقال داده شد. حال نوبت به انتخاب کلونهای باکتریایی می‌رسد که DNA نوترکیب مورد نظر به داخل آن انتقال یافته و به نحو موثری در داخل آن بیان شود. 3 خصوصیت در بین حاملین مشترک است. قدرت تکثیر در میزبان ، محل ورود ژن خارجی و یک شاخص انتخابی.

شاخصهای انتخابی موجود بر روی حاملها

مقاومت به آنتی بیوتیکها

مقاومت به آنتی بیوتیکها معمولا یا بوسیله آنزیم هایی ایجاد می‌شود که باعث غیر فعال شدن آنتی بیوتیکها می‌شوند و یا با سنتز پروتئینهایی است که به روشهای مختلف باعث ممانعت از اثر آنتی بیوتیکها می‌شوند. هر دو نوع مکانیزم مقاومت فوق بوسیله قطعات ژنتیکی ، کنترل می‌شوند. این قطعات ژنتیکی را می‌توان در حاملها وارد کرد و از آنها به عنوان شاخصهای انتقال موثر استفاده کرد.

نیازهای متابولیزمی

نیازهای متابولیزمی طیف وسیعی از مواد مختلف را شامل می‌شود. برای این کار از گونه‌های خاص از میزبان استفاده می‌شود که تونایی ساختن یک ماده متابولیزمی ضروری از دست داده‌اند، در نتیجه این باکتریها بر روی محیطهای بدون این ماده متابولیزمی رشد ، نخواهد کرد. برای مثال اگر یک باکتری توانایی تولید اسید امینه لوسین را نداشته باشد. بر روی محیط فاقد لوسین رشد نخواهد کرد.

حال اگر ما از حاملی استفاده کنیم که حاوی ژن سنتز لوسین باشد، باکتریهای میزبان حاوی این حاملها بر روی محیط فاقد لوسین رشد خواهند کرد. پس از اینکه کلنی‌های حاوی ژن نوترکیب انتخاب و جدا شدند، این کلنی‌ها را به میزان دلخواه تکثیر می‌دهند و سپس ژن تکثیر شده را برای بررسیهای بعدی استخراج کرده قرار می‌دهند.

حاملهای بیان ژن (Expression Vector)

یک حامل بیان ژن حاصل است که نه تنها می‌توان از آن به عنوان حامل کلون استفاده کرد. بلکه این حامل دارای کی توالی تنظیمی می‌باشد که باعث می‌شود که بیان ژن مورد نظر تحت کنترل مهندسی ژنتیک قرار گیرد. یک حامل بیان ژن خوب باید دارای مشخصات زیرا باشد. هر چه قدر تعداد نسخه‌های یک ژن بیشتر باشد، میزان بیان آنها بیشتر خواهد بود. پلاسمیدها از این نظر مناسب هستند. قدرت آغازگری آن خوب باشد. الگوی خواندن آن مناسب باشد. بطور کلی وظیفه مهندسی ژنتیک ایجاد یک حامل مناسب است که بتوانند بطور موثری به داخل میزبان وارد شود به تعداد همانند سازی کند بطور موثر نسخه برداری شود - بطور موثر ترجمه شود.

با استفاده از فن‌آوری DNA نوترکیب ، مطالعه ساختمان و عملکرد ژن بسیار آسان شده است و جداسازی یک ژن از یک کروموزوم بزرگ نیاز دارد به:


  • روشهایی برای برش و دوختن قطعات DNA

  • وجود ناقلین کوچک DNA که قادر به تکثیر خود بوده و ژنهایی در داخل آنها قرار داده شود.

  • روشهایی برای ارائه ناقل حاوی DNA خارجی به سلولی که در آن بتواند تکثیر یافته و کلنی‌هایی را ایجاد کند.

  • روشهایی برای شناسایی سلولهای حاوی DNA مورد نظر.

    پیشرفتهای حاصل در این فن‌آوری ، در حال متحول نمودن بسیاری از دیدگاه‌های پزشکی ، کشاورزی و سایر صنایع می‌باشد.

    پیشرفتهای حاصل از دهها سال کار هزاران دانشمند در زمینه‌های ژنتیک ، بیوشیمی ، بیولوژی سلول و شیمی فیزیک در آزمایشگاههای متعدد گرد هم آمدند تا فن‌آوریهایی برای تعیین موقعیت ، جداسازی ، آماده سازی و مطالعه قطعات DNA مشتق از کروموزومهای بسیار بزرگتر را ایجاد نمایند. تاکنون فن‌آوریهای کلون سازی DNA ، فرصتهای غیر قابل تصوری را برای تعیین هویت و مطالعه ژنهایی فراهم نموده‌اند که تقریبا در هر فرآیند بیولوژیک شناخته شده ، نقش دارند. این روشهای جدید ، تحقیقات پایه ، کشاورزی ، پزشکی ، اکولوژی ، پزشکی قانونی و بسیاری از زمینه‌های دیگر را دگرگون کرده‌اند.



طبقه بندی: بیوتکنولوژی،
[ 1390/05/15 ] [ 23:06 ] [ صادقی مهر ]
.: Weblog Themes By WeblogSkin :.
درباره وبلاگ


پژوهشسرای پروفسور حسابی وابسته به آموزش و پرورش ناحیه دو همدان تلاش می کند زمینه های فعالیتهای پژوهشی دانش آموزان را در زمینه های مختلف فراهم نماید

آمار سایت
بازدیدهای امروز : نفر
بازدیدهای دیروز : نفر
كل بازدیدها : نفر
بازدید این ماه : نفر
بازدید ماه قبل : نفر
تعداد نویسندگان : عدد
كل مطالب : عدد
آخرین بروز رسانی :
امکانات وب


اللّهُمَّ كُنْ لِوَلِیِّكَ الْحُجَّةِ بْنِ الْحَسَنِ صَلَواتُكَ عَلَیْهِ وَعَلى آبائِهِ فی هذِهِ السّاعَةِ وَفی كُلِّ ساعَةٍ وَلِیّاً وَحافِظاً وَقائِدا ‏وَناصِراً وَدَلیلاً وَعَیْناً حَتّى تُسْكِنَهُ أَرْضَك َطَوْعاً وَتُمَتِّعَهُ فیها طَویلاً

خدمات وبلاگ نویسان جوان

كد ماوس